| 專利名稱 |
對抗磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine)之單株抗體及製造該抗體之方法 |
| 公告日 |
1996/02/11 |
| 證書號 |
077586 |
| 發明人 |
王俊傑 ;張東玄 ;楊玫君 ;劉涓 ;蔡宜芬 |
| 申請人 |
行政院農業委員會 |
專利摘要:
發明係有關於專一於磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine)的單株抗體及產生該抗體的融合瘤，以及檢測磺胺二甲嘧啶含量之套組及方法。
磺胺藥由於其具抗菌、驅蟲及生長促進等功效(Anim J,Vet.Res.48(11)：1568-1573.,1987；Agri,Practice 6(1)：19-22,1985,J.Anim.Sci.64：951-956,1984)廣用於飼料中作為添加劑，其在乳品及肉品中的殘留在全世界均造成相當嚴重的問題(J.Assoc.Off.Anal.Chem.73(3)：365-362 1990.,J.Anim.Sci.67(10)：2810-2816,1989.,J.Food Prot.51(12)：920-924,1988)其中又以磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine)由於其水溶性佳、毒性低、價錢便宜，應用最廣，故其殘留問題最為嚴重，世界各國對可食用組織(edible tissues)均定有最高容許量(tolerance limit)，中華民國(76.2.21衛署食字第647195號公告)及美國為0.1ppm，而日本為0.05ppm，為了確保乳品，可食用組織(內臟、肌肉)之品質，防範磺胺藥物之殘留，各國均有專職機構負責篩檢工作。傳統用來檢測磺胺二甲嘧啶殘留的方法包括高壓液體色層分析法(H.P.L.C.)(J.Chinese Soc.Vet.Sci.15：335-340,1989)，氣體色層分析法(G.C.)，質譜(M.S.)(J.Assoc.Off.Anal.Chem.68(5)：1000-1006,1985)，薄層色層分析法(T.L.C.)(現代肉品第13期78年12月31日)等，雖然這些方法均相當敏感、準確，但樣品在測試前均需經萃取、純化等前處理步驟，費時，需要較多的人工，同時價格高昂，不便於大量樣品的篩選。相反地，利用多株或單株抗體發展出的免疫試劑，除具高特異性及敏感度外，使用方便，樣品不需前處理，便於進行大量樣品之篩檢(J.Agric Food Chem.37(1)：109-114.1981)。除了血清(J.Assoc.Off.Anal.Chem.68(2)：172-174,1985)外亦可適用於乳品(J.Assoc.Off.Anal.Chem)(J.Assoc.Off.Anal.Chem.72(3)：447-450,1989)，組織及尿(J.Assoc.Off.Anal.Chem.71(6)：1137-1140,1988)之篩檢之用，目前農委會為防範豬肉中殘留磺胺藥物，提高外銷豬肉品質，於台灣地區各家畜(肉品)市場設有監控站，對進入市場豬隻及各地區待售活豬抽樣採血，以酵素結合免疫分析法(ELISA)檢測血清中磺胺二甲嘧啶殘留量，再依據肌肉/血清殘留比值(0.24)(J.Food Protection,50：115-122,1987)，來推算肌肉中之殘留量是否超過法定容許量，惟所使用之試劑皆採整組進口，成本昂貴，每劑需百餘元，年需三萬劑，為了要降低檢驗成本，以便達到擴大全面篩選的目標，故發明人乃自行開發對磺胺二甲嘧啶具高特異性及敏感性之單株抗體，並自行配組完成檢驗試劑。
本發明提供用於檢測磺胺二甲嘧啶殘留之化合物及組成物及其方法，本發明之化合物及組成物包括融合瘤本身(其已於84年11月以第960027寄存號碼寄存於食品工業發展研究所)，及其分泌的單株抗體(10-7-24)，包含該抗體重鍵、輕鍵之可變動區域之各胜肽，及其他片段(如包含以雙硫鍵將輕鍵及重鍵結合之半分子，(Fab’)2及Fc片段等)，本發明亦包括利用上述化合物及組合物以檢測磺胺二甲嘧啶之方法，及實施該方法的套組。
本發明是以習知技術-細胞融合方式製得，其方法為將鼠源骨髓瘤細胞株與產生抗體的B淋巴細胞利用如聚乙二醇(PEG)之化合物將兩細胞融合，以HAT篩選融合瘤細胞株，再用酵素免疫法(ELISA)及競爭型酵素免疫法，分析融合瘤培養基質液中抗體之專一性，再將選取到對磺胺二甲嘧啶具專一性之單株融合瘤細胞株(10-7-24)，注入小白鼠腹腔中，產生腹水，使用蛋白質純化技術將抗體由腹水中回收，配製發展出直接競爭型酵素免疫分析(Direct Competative ELISA)之套組，此分析方法是將抗磺胺二甲嘧啶的單株抗體粘附在固相支持物之表面，測試時不同劑量標準濃度之磺胺二甲嘧啶或待測樣品與已連接有訊號(酶、螢光劑、放射元素....等)的磺胺二甲嘧啶複合物一起置入反應，由於磺胺二甲略啶會與磺胺二甲嘧啶一訊號複合物相互競爭有限的抗磺胺二甲嘧啶抗體，故藉已知濃度的磺胺二甲嘧啶標準品所產生訊號強弱可建立一條磺胺二甲嘧啶抑制所產生的標準曲線，利用此曲線而可檢測待測樣品中磺胺二甲嘧啶的是否存在及其含量。
本發明除包括融合瘤(10-7-24)細胞株及其產生的抗體與抗體之各片段，亦包括應用此抗體配製出之試劑套組，該套組包括(1)固相支持物(2)抗磺胺二甲嘧啶單株抗體(3)磺胺二甲嘧啶標準品(4)磺胺二甲嘧啶一訊號複合物(5)酵素基質(6)終止劑，固相支持物包括微滴盤(Micro-titer plate)，微球體(beads)，紙(paper)係由適宜蛋白質固定的聚氯乙烯、聚苯乙烯、硝化纖維等材料構成。訊號產生工具包括螢光物、放射性元素及酵素如過氧化氫、鹼性磷酸酯及β-半乳糖等，以上技術及反應條件為習知技術(Antibody：a Laboratory Manual.Ed.Harlow &Dayid Lane.1988)。
實例一：融合瘤(10-7-24)的製造
將磺胺二甲嘧啶-肉桂酸與牛血清白蛋白結合物(SMT-SAN-BSA)(莫爾比SMT-SAN/BSA=13.4)與Freund’s佐劑(第一次用完全佐劑之後用不完全佐劑)1：1乳化後皮下注射入BACB/C小鼠(每隻125μg BSA)，一週一次連續四次後，再每四週注射一次(每隻40μg)共進行五次，進行細胞融合的前三天，再用靜脈注射(不含佐劑)的方式追加一次，三天後將脾臟細胞與鼠源骨髓瘤細胞F0細胞株(ATCC CRL1646)以1：3之比例，用50%之聚乙二醇-400(PEG)進行融合，融合後將細胞懸浮於RPMI(HAT,20% FCS)中，稀釋成1×10 5 F0細胞，種入96孔培養盤中(0.2毫升/孔)，10天後以吸附有磺胺二甲嘧啶-4-羥基酚-醋酸-牛甲狀腺球蛋白結合物(SMT-HPN-Tg)ELISA plate，測試細胞培養上清液，選取與磺胺二甲嘧啶結合的融合瘤以限制稀釋法予以單株化，10-7-24即為用此方法選出之單株細胞之融合瘤，測其分泌的單株抗體，知其為IgG 1，此株融合瘤可予以儲存(存於-70℃及液態氮中含10% DMSO培養液中)，及使用標準之哺乳動物細胞培養技術(如含10%胎牛血清之RPMI 1640補充以1mM 穀胺醯胺及50mM2-琉基乙醇)予以培養。
實例二：單株抗體10-7-24特性分析
利用間接酵素結合免疫吸附性分析法(indirect ELISA)及競爭型間接ELISA(Competative indirect ELISA)研究10-7-24之特異性，其方法為：將磺胺二甲嘧啶-4-羥基酚醋酸-牛甲狀腺球蛋白球蛋白結合物(SMT-HPN-Tg莫爾比：SMT-HPN/Tg=8.2)0.3 μg/well牛甲狀腺球蛋白吸附於96 well ELISA plate上(4℃，隔夜)後用0.1%skim milk-PBS於37℃作阻斷(Blocking)30分鐘後，用0.05% Tween 20-PBS(PBST)洗三次，將10-7-24(0.2μg/ml)的抗體單獨或與稀釋於PBS-0.1% BSA中之不同濃度的磺胺二甲嘧啶1.0-0.002ppm或他種的磺胺劑(藥品及劑量見表一)1：1(V/V)混合後於37℃反應30分鐘後，加入經阻斷過的ELISA plate上，於37℃反應一小時後，用PBST洗三次，再加入goat anti-mouse IgG-HRPO(1：8000),37℃反應一小時，再用PBST洗五次後，加入受質TMB溶液，反應20分鐘，用2N HCl中止反應，測OD 450/650nm後計算抑制百分率(1-OD test/OD 0 SMT)其中OD0為10-7-24單獨(不含SMT或其他藥劑)之OD，圖一為0.2μg/ml之10-7-24與不同終濃度(0.5-0.001ppm)的磺胺二甲嘧啶所形成的抑制曲線，若以大於20%抑制(零值之coefficient of variation(cv)標準偏差之二倍)來算則10-7-24可檢測SMT的最低量(Sensitivity)約為0.01ppm，10-7-24僅對SMT具高特異性，於10ppm的十二種非SMT之磺胺劑及1ppm的Sulfamerazine均不會產生>20%之抑制反應(表一)。
實例三：檢測磺胺二甲嘧啶殘留的直接競爭ELISA法
製備磺胺二甲嘧啶一過氧化氫酵素連接物其方法為：先將過氧化氫酵素於pH=4.5的醋酸鈉溶液中用過碘酸鈉(25mM)氧化0.5 hr後透析除去過碘酸鈉，再加入磺胺二甲嘧啶-肉桂-聯氨，於室溫反應1小時，再用碳酸鈉緩衝液調pH至9.5，再加入硼氫化鈉(20mM)於4℃過夜還原後，於醋酸鈉透析後，分裝儲存於-70℃備用。
將10-7-24(0.4μ)溶於carbonate buffer pH=9.6,200微升附著在96孔聚苯乙烯微孔盤之每孔表面上，於4℃過夜培養後，以0.05% PBS-Tween 20沖洗去除未結合之抗體，用0.1%-脫脂奶粉-PBS，於37℃阻斷30分鐘，測試時，將溶於不含SMT的豬血清中之磺胺二甲嘧啶的標準品0.42,0.2,0.1,0.04ppm(分別相當於肌肉中0.38,0.1,0.05,0.025,0.0096ppm)或待測豬血清用PBS-0.1%BSA做相同倍數(一般20-40倍)的稀釋後，取100μl分別加入微孔中，接著再加入連接有過氧化氫酵素的磺胺二甲嘧啶之稀釋液100μl，混合後於室溫反應10分鐘，用0.05% PBS-Tween 20沖洗後加入100μl之過氧化氫酵素受質TMB，於室溫避光反應10鐘，然後用100μl之2N HCl中止反應，測定OD450/650值，表二結果顯示此分析法(依>20%抑制來算)至少可檢測到血清中標準品0.04ppm(相當於肌肉中0.0096ppm)之磺胺二甲嘧啶，同時對其他13種磺胺藥不會造成交叉反應(圖一)，用此分析法所測得之豬血清樣本之SMT量與用HPLC法所得之結果成正相關，同時其相關係數高達0.97(圖三)。
圖一係磺胺二甲嘧啶用間接競爭ELISA所形成之標準抑制曲線圖；圖二係磺胺二甲嘧啶用直接競爭ELISA所形成之標準抑制曲線圖；及圖三係血清樣品之HPLC與ELISA比對試驗圖。
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